Вагинальный и эндометриальный микробиом: оценка, влияние на имплантацию эмбриона

Введение

Репродуктивный микробиом является новой темой в области акушерства и гинекологии [1–6]. В частности, особый интерес представляет микробиом полости матки, а именно эндометрия — анатомической ниши, где микроорганизмы с низким содержанием биомассы могут модулировать местную иммунную среду [7]. Интерес в первую очередь обусловлен влиянием микробиоты на имплантацию эмбриона и формирование плаценты, что потенциально влияет на фертильность и развитие акушерских осложнений [2][4][8][9]. Недавние исследования показали, что в контексте экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) микробиота эндометрия, в которой не доминируют лактобациллы (определяемая как <90% Lactobacillus spp.) была связана со значительным снижением показателей имплантации, беременности и живорождений [10–12].

В настоящем исследовании мы предлагаем для получения образцов эндометрия и оценки микробиоты использовать двуполостные маточные катетеры с цанговой направляющей собственной модификации, обычно используемые для переноса эмбрионов. Ожидается, что эта система маточного катетера уменьшит возможную контаминацию микроорганизмами шейки матки и влагалища. Чтобы исследовать достоверность этой модальности сбора образцов, мы сравнили микробиоты эндометрия и влагалища у инфертильных женщин, запланировавших процедуру ЭКО и перенос замороженных эмбрионов. В качестве вторичной цели мы также оценили связь полученной микробиоты с последующей вероятностью беременности.

Цель исследования — оценка микробиома влагалища и полости матки с использованием маточного катетера с цанговой направляющей у инфертильных пациенток перед проведением процедуры экстракорпорального оплодотворения.

Материалы и методы

В исследования участвовало 73 женщины (средний возраст — 34,1±3,7 лет) с инфертильностью перед подготовкой к циклу ЭКО или интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ), имеющие бластоцисты для криопереноса в 5 центрах репродукции г. Краснодара (Клиника Кубанского государственного медицинского университета (КубГМУ), центр планирования семьи Краевого перинатального центра Детской краевой клинической больницы (ДККБ), центр репродукции клиники «Екатерининская», клиника мужского и женского здоровья «OXY-center», клиника репродукции «Эмбрио») в период с 01.2021 по 01.2023 гг. (табл. 1).

Критерии исключения: 1) текущий диагноз «Воспалительное заболевание органов малого таза» (ВЗОМТ); 2) наличие гидросальпинкса; 3) клинически значимые аномалии полости эндометрия, включая миому, полипы эндометрия и маточную перегородку, синдром Ашермана; 4) проведённая в течение последнего месяца антибактериальная терапия; 5) гормональное лечение (прогестины, эстропрогестины или гонадотропины) в течение последнего месяца; 6) аномальное маточное кровотечение; 7) перенос эмбрионов, запланированный в том же менструальном цикле. Женщины, согласившиеся на участие, были проинформированы о цели исследования, возможном дискомфорте процедуры и возможных рисках и подписали информированное согласие.

Образцы из полости матки для микробиологического исследования брались у женщин, находящихся в литотомическом положении на гинекологическом кресле с осмотром в зеркалах (типа Куско) между 15 и 25 днями естественного менструального цикла. Отбор проб производился с трансабдоминальной ультразвуковой визуализацией. Сначала брался образец вагинальной микрофлоры с заднего свода влагалища (стерильный тампон), затем, после удаления цервикальной слизи стерильным тампоном, максимально избегая контакта со стенками влагалища и нестерильными поверхностями, вводился маточный двухпросветный цанговый зонд, проводился забор материала эндометрия, после чего проводилось закрытие цанги и зонд извлекался (рис. 1).

Содержимое зонда суспендировали в 150 мкл стерильного физиологического раствора, предварительно приготовленного в 1 мл стерильной пробирки Эппeндорфа, затем дистальную часть катетера (2–3 мм) отламывали и опускали внутрь пробирки вместе с физиологическим раствором (пробирку хранили при температуре −80°C).

На момент оценки образцы из влагалища и полости матки размораживали и выделяли бактериальную ДНК для её исследования методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов «Фемофлор-16» (ООО «НПО ДНК-Технология», РФ): ДНК выделяли из 100 мкл пробы с использованием набора реагентов «Проба-ГС». Этот тест позволяет одновременно амплифицировать и обнаруживать целевые нуклеиновые кислоты микрофлоры, ассоциированной с бактериальным вагинозом: Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Megasphaera, Mobiluncus spp., Bacteroides fragilis, а также Lactobacillus spp. (L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii). Анализ обеспечивает автоматическую интерпретацию микрофлоры с использованием количественного анализа.

Секвенирование 16S рРНК бактериальных генов выполняли с использованием набора раствора микробиоты B для гипервариабельных областей V3-V4-V6 путём использования дегенеративных праймеров, включающих в себя 2 исследования: EMMA® (Endometrial Microbiome Metagenomic Analysis — анализ микрофлоры эндометрия для оценки репродуктивного прогноза) и ALICE® (Analysis of Infectious Chronic Endometritis — анализ патогенной микрофлоры эндометрия («Igenomix», Spain)) [14][15]. Полученная амплификация гипервариабельных областей V3–V4–V6 позволяет идентифицировать большинство бактериальных популяций, присутствующих в микробиоте. Данные секвенирования анализировались автоматически с помощью программного обеспечения MicrobAT (Microbiota analysis Tool, Igenomix, Spain), предоставляющего отчёт для каждого образца с назначением операционных таксономических единиц (OTU).

Данные анализировались с помощью программного обеспечения Statistical Package for Social Sciences (SPSS 23.0, IL, США). Данные были представлены как число (%), среднее ± SD или медиана (межквартильный диапазон (interquartile range) — IQR). Сравнения проводились с использованием T-критерия Стьюдента, непараметрического критерия Фишера (значения p<0,05 считались статистически значимыми). Относительная доля различных бактериальных родов была рассчитана с использованием в качестве знаменателя только общего числа информативных считываний. Микробиом эндометрия считался лактобацилло-доминантным, если относительное содержание Lactobacillus превышало 90%. Индекс Шеннона (SH) и индекс эквивалентности Шеннона был рассчитан программным обеспечением MicrobAT.

Исследование было одобрено Этическим комитетом КубГМУ (протокол №17 от 12.01.2021) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией (пересмотр 2013, Бразилия), правилами Надлежащей клинической практики (GCP; 2016, Астана) и клинической практики в РФ (приказ МЗ РФ №200н, 2016). Обследование пациенток проводилось согласно приказам МЗ РФ №1130н от 20.10.2020 г. «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология», №803н от 31.07.2020 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению», клиническим рекомендациям «Женское бесплодие» (2021).

Результаты

Межквартильный диапазон (IQR) — общее число показаний последовательностей для эндометрия и вагинальных образцов составило 2583 (385–6083) и 3822 (910–6920) соответственно, IQR-индексы Шеннона для них составили 2,73 (2,49–3,17) и 1,70 (1,44–2,22) (p<0,001), IQR-индексы эквитабельности Шеннона — 0,57 (0,52–0,74) и 0,44 (0,40–0,53) (p<0,001). Преобладание лактобациллярной микрофлоры отмечено в 30,1% (22/73) эндометриальных и 53,4% (39/73) вагинальных образцов; у 86,3% (19/22) женщин, у которых Lactobacillus spp. был наиболее распространённым видом в образцах эндометрия, также имели Lactobacillus в качестве наиболее распространённого вида во влагалищных образцах. Пациентки, микрофлору которых можно было классифицировать как Lactobacillus-dominantus (Lactobacillus >90%), выявлены в 8,2% (6/73) эндометриальных и 41,1% (30/73) вагинальных образцов (индекс корреляции Спирмена между долей Lactobacillus spp. в эндометриальных и вагинальных образцах составил Rho=0,53, p<0,001 — слабая корреляция) (табл. 2).

Доминантные бактериальные роды микробиоты эндометрия и влагалища совпали только у 9,6% (7/73) женщин. Для эндометрия наиболее распространёнными бактериальными родами были Lactobacillus, Pelomonas, Propionibacterium, Pseudomonas, Streptococcus и Escherichia coli (табл. 2-3). Для влагалища это были Lactobacillus, Gardnerella и Bifidobacterium.

При этом данные мультиплексной ПЦР-РВ в эндометриальных образцах существенно не совпадали с результатами 16sрРНК секвенирования, что представляется логичным, так как система ПЦР-детекции в первую очередь направлена на обнаружение микрофлоры, ответственной за развитие бактериального вагиноза и не является тропной к эндометрию (табл. 3).

Результаты

Далее 89,0% (65/73) пациенткам произведён перенос размороженных эмбрионов 3–5 дня (8 женщинам перенос был отменён, так как не была достигнута оптимальная толщина эндометрия). Регистрировалась лишь клиническая беременность (визуализация сердечной деятельности на 6-й неделе), которая наблюдалась у 31,5% (23/73) женщин, живорождение — у 24,7% (18/73) пациенток (у 5,5% (4/73) произошел самопроизвольный выкидыш, у 6,8% (5/73) —преждевременные роды (22–36 недель гестации), остальные 19,2% (14/73) родоразрешены в доношенном сроке беременности).

Из 23 женщин с успешным результатом ЭКО (параметр — наступившая клиническая беременность) преобладание лактобациллярной микрофлоры в эндометриальных и вагинальных пробах было отмечено у 11 (47,8%) – 2 (8,7%) в эндометрии и 9 (39,1%) — во влагалище (p=0,16). При этом не отмечено существенных различий между группами с положительным и отрицательным результатами ЭКО: индекс Шеннона для образцов эндометрия между беременными и небеременными женщинами составил 2,41 (1,12–3,90) и 3,29 (2,84–3,82) (p=0,036) соответственно, индекс эквитабельности Шеннона — 0,76 (0,57–0,87) и 0,55 (0,51–0,64) (p=0,002), что может свидетельствовать о более высоком биоразнообразии в связи с установлением беременности, но, учитывая количество выборки, не является достоверным (рис. 1–2).

Статистически значимая разница выявилась для обоих индексов в микробиомах эндометрия (p=0,036 и p=0,002 соответственно), и, наоборот, никаких существенных различий для вагинальных микробиомов не наблюдалось.

Обсуждение

Небеременные результаты данного исследования с использованием авторского метода получения проб эндометрия позволили выявить существенные различия в таксономии между составом эндометрия и вагинального микробиома, что подтверждает его обоснованность. При этом не получено подтверждения о выраженном положительном влиянии доминирования лактобациллярной микрофлоры эндометрия на успех ЭКО, как и об отрицательном влиянии условно-патогенной флоры, ответственной за развитие локальных генитальных дисбиозов. Интересно, что мы наблюдали более высокие показатели индексов Шеннона среди женщин с положительным результатом переноса эмбриона (наступления клинической беременности).

До настоящего времени в клинической практике были попытки преодолеть контаминацию цервико-вагинальным содержимым образцов эндометрия. Liu et al. (2019) использовали катетер с двойной оболочкой для получения образца эндометрия [21]. Зарегистрированные ими результаты о более выраженной контаминации эндометрия по сравнению с вагинальными образцами Lactobacillus неоднозначны. При этом другие исследователи (Carosso et al., 2020), которые использовали двухпросветные катетеры для переноса эмбрионов, показали среднюю частоту Lactobacillus (27%), что корреспондирует с результатами большинства исследований [22]. Так, Verstraelen et al. (2016) использовали трансцервикальное устройство с силиконовой щеточкой в оболочке и предназначенное для сбора гистообразцов эндометрия и не смогли показать доминирование Lactobacillus в его микробиоме, при этом сообщается о довольно «грубом» воздействии данной цитощетки, нарушающей целостность эндометрия [23]. Qiu et al. (2021) которые выполняли с целью обхода контаминации гистероскопический забор образцов, сообщали о еще более низкой частоте обнаружения Lactobacillus — 7% (существенным недостатком данного метода является его сложность и инвазивность) [24]. Таким образом, до настоящего времени наиболее успешным было использование двухпросветных катетеров для переноса эмбрионов [25][26]. Но при этом методе всё же существует риск загрязнения при прохождении внутреннего катетера через наружный. Используемая нами модель за счёт открытия/закрытия цангового механизма помогает преодолеть этот риск.

Также мы попытались провести параллели между составом микробиома эндометрия и результативностью ЭКО, но полученные результаты имели некоторый контраст с другими исследованиями [12]. Особое значение имеет скудная частота лактобацилл-доминантных случаев у наших пациенток и отсутствие связи состава эндометриальной микробиоты с результатами ЭКО. При этом результаты данного исследования не ставят под сомнение выводы Moreno et al. (2016) о связи доминирования лактофлоры и положительным результатом, но ставят под сомнение тот факт, что у этих авторов действительно были данные о микробиоме эндометрия (более правдоподобно, что их выводы были сделаны на основании оценки цервикальной микрофлоры). Интересным и неожиданным результатом нашего исследования является связь между более высоким альфа-разнообразием и вероятностью наступления беременности в протоколах ЭКО: 2 показателя разнообразия (индексы Шеннона и эквитабельности) выявили статистически значимые различия между женщинами с положительными и отрицательными результатами переноса эмбрионов. При этом, по нашему мнению, необходимо провести дальнейшие исследования по оценке биоразнообразия микробиоты эндометрия и его роли в реализации фертильности.

Наконец, данные использования мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (фемофлор 16) указывают на то, что этот метод не совсем подходит для анализа образцов эндометрия, но при этом способен подтвердить различия между вагинальными и эндометриальными колонизирующими микроорганизмами.

Заключение

Наши данные подтвердили эффективность использования двухпросветных зондов с цанговым механизмом для тестирования микробиома эндометрия, что создает новые перспективы как для изучения его биоразнообразия, так и для определения его роли в рецептивности эндометрия и, соответственно, женской фертильности.